原文链接：

https://aem.asm.org/content/early/2020/11/02/AEM.02192-20.long

Fig.1 FSFC对Fe2⁺溶液中的灵敏度、选择性和稳定性。(A) FSFC荧光光谱对不同浓度Fe2⁺的响应。(B) Fe2⁺浓度与荧光强度FI的关系为对数关系。(C) FSFC对Fe2⁺的选择性测试。(D) FSFC与传统邻菲罗啉法的相对稳定性。

2. 活性FeRM还原可溶性和固态Fe3⁺的荧光成像。

       前人的研究已经广泛证实了Shewanella和Geobacter的还铁能力。此外，有报道称，在用FeRM法还原铁的过程中，磷酸亚铁和碳酸亚铁在细胞表面聚集。实验结果表明与非铁还原菌相比S12和MR-1细菌表面的Fe2⁺浓度高很多。使用S. decolorationis S12、S. oneidensis MR-1、G. sulfurreducens PCA三种模式铁还原菌进行可溶性柠檬酸铁还原时发现细胞荧光强度与二价铁浓度呈良好的线性关系（图2 A-E, G）。

       Fe在自然界中主要以固体的形式存在，本研究发现上述模式菌在还原无定形水铁矿的过程中的Fe2⁺浓度也与荧光强度呈一致性变化趋势。值得关注的是，在用于Geobacter无定形铁还原测试时，仅有接触铁颗粒的细胞呈现荧光，而未接触铁颗粒的细胞几乎无荧光（图2F），与该菌依赖直接接触的铁还原方式一致，表明FSFC具有判断细菌细胞是否正在进行铁还原的能力。

Fig.2 FSFC在氧、可溶性Fe3⁺或固态Fe3⁺为电子受体的情况下对菌株PCA的荧光响应。

3. 评价不同细菌的铁还原能力。

       除铁还原能力外，不同属细菌通常具有不同的形状、表面性质和代谢物，这些都可能影响FSFC的荧光。为了进一步分析FSFC的选择性，我们使用FSFC对5个盲菌标本进行了检测。从沉积物中分离出五种还原铁性能未知的细菌。

       实验表明，与预期的结果一样， S12和 MR-1显示荧光，阴性对照无荧光。在5个盲样细菌中，只有P. motobuensis Iβ12有荧光，但FI低于S12。其余细菌均无荧光(图4A-G)，所以不同细菌的贴还原能力差异较大，且FSFC探针对不同菌的评价结果与经典邻菲罗啉法一致。

Fig.4：FSFC对含有柠檬酸铁的不同细菌培养物的荧光图像。 (A) Ciceribacter sp. F217, (B) S. hydrophobicum C1, (C) Bacillus Iβ8, (D) L. varians GY32, (E) P. motobuensis Iβ12, (F) S. decolorationis S12, (G)基于邻菲罗啉法的不同菌株的铁还原测定。

4. FeRM与其他细菌共培养

       FeRM和与其他功能的细菌共培养是了解FeRM与其他细菌之间相互作用的重要方法。

       为了测试FSFC是否可以在共培养系统中鉴定出FeRM，作者使用乳酸作为电子供体共培养了丝状非FeRM 菌株GY32和杆状菌株S12。如图5A所示，杆状菌株S12显示出强荧光，而丝状细菌GY32在相同的铁还原培养物中没有荧光。可以看出，FSFC可以选择性地选择微生物样品中的FeRM。为了评价FSFC在更复杂环境下的可行性，用FSFC在含柠檬酸铁的灭菌底泥中共培养GY32和S12。图5C显示在没有共培养的沉积物中，只有少数颗粒显示荧光，这可能是由于这些沉积物颗粒上固有的Fe 2⁺引起的，而没有细菌样颗粒显示出荧光。结果表明，FSFC在沉积物中的背景荧光很小，沉积物中非活性微生物不能触发FSFC的荧光。在共培养系统中，如图5D显示，S12表现出显著的荧光，而丝状细菌GY32没有荧光，表明FSFC在含沉积物的环境中可视化FeRM的可行性。

Fig.5 S12和GY32共培养的荧光图像

5.可视化并从混合物中分离单细胞FeRM

       除了可视化FeRM外，从多物种样品中分离FeRM对于了解铁相关的生物地球化学过程是一个普遍而重要的需要。作者结合FSFC和PI来标记富铁还原反应中的生物膜。CLSM显示，活跃的FeRM细胞主要位于生物膜的外层，而内层生物膜细胞活性较低，FSFC荧光较少，如图6A. 7个有荧光的单细胞和6个没有荧光的单细胞通过单细胞分选仪从沉积物富集的菌群中分离出来(图6)。其中有3个分离的荧光单细胞被成功培养，它们都可以使用醋酸盐作为电子供体来还原柠檬酸铁(图6G)，进一步证实了FSFC在FeRM分选中的可靠性。

Fig.6 基于FSFC可视化单细胞分选铁还原菌。